妊娠奶牛奶对雌性SD幼鼠生长发育和血脂的影响

妊娠奶牛奶对雌性SD幼鼠生长发育和血脂的影响[1]

徐庄剑1，庞兴甫1，张文杰1，马亚萍1，许国新2，周 渊2江南大学附属医院儿科徐庄剑

(1.苏州大学第四临床医学院 儿科，江苏 无锡  214062；2. 苏州大学第四临床医学院 检验科，江苏 无锡  214062)

该文已刊登在《食品科学》2010年第7期

摘  要： 目的： 观察妊娠奶牛奶对雌性SD幼鼠生长发育和血脂的影响。方法： 64只21日龄雌性SD幼鼠，随机等分为4组，分别定量喂食妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶。于29和54日龄时观察生长发育指标并检测血脂等。结果： 上述4组54日龄时血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度(mmol/L)分别为0.66±0.07、0.60±0.04、0.69±0.07和0.56±0.12，其中妊娠奶牛奶组高于实验配方奶组(P＜0.05)，市售纯牛奶组高于产后奶牛奶和实验配方奶组(P＜0.05)，其余各组间差异均无统计学意义；29日龄时其各组间差异也无统计学意义。29及54日龄时血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇组间差异均无统计学意义。结论： 妊娠奶牛奶或以妊娠奶牛奶为主的市售纯牛奶可能升高雌性SD幼鼠血清HDL-C水平。

关键词： 妊娠奶牛奶；雌性幼鼠；雌二醇；孕酮；血脂

中图分类号：TS201.2；TS252.1；Q591.5  文献标识码：A   文章编号：

Effects of Pregnant Cow’s Milk on Both the Growth and Development and Blood Lipid Metabolism in Juvenile Female SD Rat

XU Zhuang-jian1, PANG Xing-fu1, Zhang Wen-jie1, MA Ya-ping1, XU Guo-xin2, ZHOU Yuan2

(1. Department of Pediatrics, The No.4 Department of Clinical Medicine of Soochow University, Wuxi 214062, China; 2. Department of Clinical Laboratory, The No.4 Department of Clinical Medicine of Soochow University, Wuxi 214062, China)

Abstract: Objective: To investigate the effects of pregnant cow’s milk on both the growth and development and blood lipid metabolism in juvenile female SD (Sprague-Dawley) rat. Methods: Sixty four female SD rats aged 21 days old were randomly assigned to pregnant cows milk, postpartum cows milk, commercial whole milk and artificial milk group. The indexes of growth and development were observed. Blood lipid were determined at 29 and 54 days old. Results: There was no statistically significant difference in serum high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) among 4 groups at 29 days old. Serum HDL-C (mmol/L) for pregnant cows milk, postpartum cows milk, commercial whole milk and artificial milk group were respectively 0.66 ± 0.07, 0.60 ± 0.04, 0.69 ± 0.07 and 0.56 ± 0.12 at 54 days old. And serum HDL-C in pregnant cows milk group was higher than that in artificial milk group(P<0.05), and it in commercial whole milk group was higher than that in postpartum cows milk and artificial milk group (P<0.05 in both), and there were no statistically significant differences among other groups. There were no statistically significant differences in serum total cholesterol, triglyeride and low-density lipoprotein cholesterol among 4 groups at 29 or 54 days old. Conclusions: Pregnant cows or commercial whole milk (mainly from pregnant cows) may perhaps increase serum HDL-C in juvenile female SD rat.

Keywords: pregnant cow’s milk；juvenile female rat；estradiol；progesterone；blood lipid

近年来，随着血脂异常相关性疾病的年轻化，儿童血脂水平及其相关疾病的研究已逐步引起学术界的关注。日本磐田市和我国部分地区流行病学调查均显示儿童血脂水平[1-2]有逐年上升趋势。雌性激素是影响血脂水平的主要因素之一，一定水平的食源性雌性激素可影响人体内血脂水平。牛奶是人类的主要食品之一，其雌性激素水平较100年前明显增高[3]，与人类健康关系的研究主要集中于成人激素相关性肿瘤的流行病学调研[4-5]和对动物发育的影响[6]等，但与人类血脂代谢关系的研究甚少，尤其是儿童。本研究旨在观察妊娠奶牛奶中雌性激素对雌性幼鼠生长发育和血脂代谢的影响，为开展相关动物实验和临床研究提供动物实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用奶及其储存

(1)妊娠奶牛奶：采集4头妊娠奶牛(妊娠212～221d)奶混匀。(2)市售纯牛奶：从市场购买同一品牌11个不同批号的某市售纯牛奶，拆装混匀。(3)产后奶牛奶：采集2头产后奶牛(产后56～61d)奶混匀。(4)实验配方奶：详见1.2.2。除实验配方奶为现用现配外，其余3种牛奶均－20 ℃储存。

1.1.2 实验动物

64只19日龄清洁级雌性SD幼鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号为SCXK(沪)2007-0005。

1.1.3 试剂与仪器

ACCESS全自动微粒子免疫化学发光分析仪及配套试剂  美国Beckman公司；HI 7170A全自动生物化学分析仪及配套试剂  日本Hitac公司；硫酸酯酶(批号009016175))   西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 奶液中蛋白质、脂肪和乳糖水平的测定

用凯氏定氮法、哥特里-罗兹法和莱茵-埃农氏法分别检测妊娠奶牛奶、产后奶牛奶和市售纯牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖水平。

1.2.2 实验配方奶配制及各组幼鼠奶液能量摄入相对平衡方法

根据妊娠奶牛奶、产后奶牛奶和市售纯牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖水平检测结果，在配制实验配方奶时使其蛋白质、脂肪和乳糖分别与上述3种牛奶中各成分最高者对应相同，并添加主要维生素和微量元素[7]。每100 ml实验配方奶配制如下：脂肪(椰子油)6.07 g、蛋白质(按谷朊粉的蛋白含量折算)6.447 g、碳水化合物(淀粉)7.440 g、元素钙(按钙尔奇D300咀嚼片的钙含量折算)120 mg、元素磷(按磷酸氢二钠的磷含量折算)93 mg、元素铁(按右旋糖酐铁片的铁含量折算)0.2 mg、VA 140 IU、VB1 0.04 mg、VB2 0.13 mg、VPP 0.2 mg和VC 1 mg。同时在妊娠奶牛奶、产后奶牛奶和市售纯牛奶中添加一定比例的蛋白质、脂肪和乳糖，使4组的三大产能营养素含量对应相同，以保证各组奶液能量摄入处于相对平衡。

1.2.3 奶液总雌二醇(TE2)的测定

免疫化学发光法(ICMA)检测乳清雌二醇(E2)，可靠检测范围为20~2000 pg/ml，检测批间差小于8%。奶液中的E2有游离型和结合型两种形式，结合型主要与硫酸根离子结合，因此需先用硫酸酯酶水解法将结合型E2转变为游离型，再检测样本中TE2水平[8]，具体方法为：取奶样2ml，离心(14000r/min)90min，抽取乳清0.45ml，加入0.5ml乙酸钠缓冲液后，再加入0.05ml硫酸酯酶溶液(含25 U硫酸酯酶)，在37℃水浴下孵育21h，检测上述混合液(乙酸钠为100mmol/L，氯化钠为0.02%)中的E2，连测3次，取其均值。TE2浓度=所测浓度/0.45。

1.2.4 奶液P4的测定

应用ICMA直接检测乳清中孕酮(P4)，连测3次，取其均值。

1.2.5 动物实验步骤

64只19日龄清洁级雌性SD幼鼠称重后编号，随机等分为妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶组4组，置动物房适应环境2d，温度(20±2) ℃，一鼠一笼。从21日龄开始由专人采用特制负压喂奶瓶(自制)定量喂奶，喂食前平均禁食禁水5h。由于幼鼠进奶量逐日增加，因此前7d、中间17d和后8d每天分别喂食10、20和30 ml。在规定的奶量完成后自由取食鼠饲料和水。定期测量体重、尾长和身长。于28日龄每组随机选取8只收集24h尿并记录尿量，留5 ml置－80 ℃储存备测尿总雌三醇(TE3)、P4和肌酐(Cr)，29日龄（青春期启动前）处死。剩余幼鼠每日3次行阴道涂片观察动情周期[9]，54日龄（青春期启动后）处死。

1.2.6 幼鼠处死时的取材及检测

幼鼠均于麻醉后测量体重、身长和尾长；心脏取血分离血清检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C )；29日龄检测血清P4，54日龄检测空腹血糖；取卵巢、子宫和阴道，用分析天平(精确读数至0.001g)称量湿重，并计算生殖器官脏器指数(脏器湿重/体重)。

1.3 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差( ±s)表示。各组实验数据均进行正态性 (Shapiro-Wilk法)和方差齐性(Levene法)检验，若符合正态分布和方差齐性，则采用方差分析，4组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，均数间两两比较采用 Student-Newman-Keuls检验；若不符合正态分布或方差不齐，则采用秩转换的非参数检验，4组间均数比较采用Kruskal-Wallis H检验，多个样本均数间两两比较采用多重比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 奶液TE2 和P4 检测结果

妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶乳清中TE2浓度(pmol/L)分别为861.75、649.74、883.52和625.26；P4浓度(nmol/L)分别为14.21、9.03、11.64和2.19。

2.2 各组幼鼠体格生长指标

在实验全过程中各组幼鼠体重、身长和尾长差异均无统计学意义。                  

2.3 各组幼鼠29日龄24h尿TE3和P4 及血清P4水平

各组幼鼠29日龄24h尿TE3/Cr分别为(1.46±0.54)×10-6、(1.59±0.43)×10-6、(1.57±0.60)×10-6和(1.39±0.29)×10-6，差异无统计学意义(F=0.301, P=0.824)；24h尿P4/Cr分别为(68.10±21.69)×10-6、(67.35±32.10)×10-6、(45.01±18.18)×10-6和(55.58±11.52)×10-6，差异无统计学意义(H=6.947, P=0.074)；

血清P4(nmol/L)分别为(68.47±64.25)、(46.71±32.46)、(43.01±20.50)和(78.42±77.10)，差异无统计学意义(H=0.713, P=0.870)。

2.4 各组幼鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 及54日龄空腹血糖水平

上述4组幼鼠29日龄血清TC、TG、HDL-C和LDL-C差异均无统计学意义。4组幼鼠54日龄空腹血糖(mmol/L)分别为11.21±1.58、11.06±1.16、11.25±1.31和10.36±1.20，差异无统计学意义(H=3.014, P=0.389)。54日龄血清TC、TG和LDL-C差异均无统计学意义，HDL-C妊娠奶牛奶组高于实验配方奶组(d妊娠奶牛奶组，实验配方奶组＝8.875，P<0.05)、市售奶牛奶组高于产后奶牛奶组(d市售奶牛奶组，产后奶牛奶组＝11.375，P<0.05)，市售奶牛奶组高于实验配方奶组(d市售奶牛奶组，实验配方奶组＝12.375，P<0.05)，其余各组间差异均无统计学意义，见表1。

表1  青春期前和青春期幼鼠血脂水平(mmol/L)

Table 1  The blood lipid levels of rats at prepuberty and puberty(mmol/L)

组      别

29日龄

54日龄

TC

TG

HDL-C

LDL-C

TC

TG

HDL-C

LDL-C

妊娠奶牛奶组

2.8±0.53

0.4±0.11

0.8±0.16

0.4±0.11

2.23±0.24

0.40±0.18

0.66±0.07

0.16±0.04

产后奶牛奶组

2.5±0.28

0.37±0.08

0.75±0.03

0.4±0.12

2.06±0.25

0.28±0.05

0.60±0.04#

0.15±0.02

市售纯牛奶组

2.7±0.45

0.4±0.17

0.8±0.10

0.4±0.12

2.57±0.49

0.36±0.15

0.69±0.07

0.16±0.02

实验配方奶组

2.7±0.44

0.3±0.06

0.8±0.11

0.3±0.12

2.06±0.52

0.30±0.06

0.56±0.12#*

0.16±0.05

F值

1.031

2.298

－

1.031

－

－

－

－

H值

－

－

6.433

－

6.590

3.818

9.968

1.601

P值

0.394

0.099

0.092

0.394

0.086

0.282

0.019

0.659

注： #表示与市售纯牛奶组相比，P<0.05；*表示与妊娠奶牛奶组相比，P<0.05。

2.5 各组幼鼠生殖系统发育状况

4组幼鼠54日龄时幼鼠动情周期次数、动情期涂片总数和动情期涂片百分比(每只幼鼠阴道涂片中动情期片数/该幼鼠阴道涂片总片数)差异均无统计学意义；4组幼鼠29和54日龄时子宫、卵巢和阴道脏器指数差异均无统计学意义(表2)。

表2  各组幼鼠生殖器官脏器指数(mg/g)

Table 2  The indices of reproductive organs in all groups (mg/g)

组      别

29日龄

54日龄

子宫

卵巢

阴道

子宫

卵巢

阴道

妊娠奶牛奶组

1.41±0.55

0.67±0.13

0.73±0.32

2.76±0.83

0.80±0.15

0.87±0.17

产后奶牛奶组

1.98±1.55

0.71±0.20

0.74±0.24

1.84±0.63

0.69±0.08

0.68±0.23

市售纯牛奶组

1.21±0.49

0.63±0.11

0.76±0.16

2.34±0.99

0.78±0.17

0.84±0.16

实验配方奶组

1.30±0.78

0.64±0.19

0.65±0.19

2.16±0.76

0.73±0.07

0.77±0.25

F值

－

0.419

0.345

－

1.128

1.345

H值

1.759

－

－

4.352

－

－

P值

0.624

0.741

0.793

0.226

0.355

0.280

3 讨  论

与Ganmaa等[8]和本课题组前期的[6]动物实验研究相似，本研究妊娠奶牛奶对雌性幼鼠体重、身长和尾长指标影响均无统计学意义，提示其对雌性幼鼠体格生长无明显影响。与李湘鸣等[10-11]未发现牛奶中雌激素样物质对雌、雄大鼠生殖腺有明显影响的研究相类似，本研究妊娠奶牛奶对青春期启动前及启动后雌性幼鼠生殖器官脏器指数的影响均无统计学意义；本研究也显示其对青春期启动前雌性幼鼠尿TE3、尿P4和血清P4、青春期启动后的动情周期次数、动情期涂片总数和动情期涂片百分比的影响均无统计学意义，进一步佐证了妊娠奶牛奶对雌性SD大鼠生殖腺无明显影响；本课题组前期研究现代市售纯牛奶喂养雌性SD幼鼠(每天每只20ml，10d)后24h尿雌三醇和P4排泄增多[6]，且妊娠奶牛奶组24h尿雌三醇和P4排泄也有增多现象[12]，而本研究显示妊娠奶牛奶喂养雌性幼鼠(每天每只10ml，7d)后青春期启动前尿TE3、尿P4和血清P4影响均无统计学意义，其差异可能与干预时间及摄入的奶液量不同等有关。

本研究还显示妊娠奶牛奶对雌性幼鼠青春期启动前血清TC、TG、LDL-C和HDL-C、青春期启动后血清TC、TG、LDL-C和空腹血糖的影响均无统计学意义，而且，青春期启动后妊娠奶牛奶组的HDL-C高于实验配方奶组，市售纯牛奶组高于产后奶牛奶和实验配方奶组(P＜0.05)，提示妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶可能对雌性幼鼠的心血管等具有一定保护作用。本研究显示的妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶可能提高雌性幼鼠血清HDL-C的现象尚未见文献报道，有待进一步证实和研究。

牛奶除含有水分、脂肪、蛋白质、维生素及微量元素等外，还含有雌性激素。本研究在实验过程中已使各组奶液中蛋白质、脂肪、乳糖、主要维生素和微量元素相对平衡，因而基本排除了因奶液中这些成分的差异对血脂影响的可能性。

妊娠奶牛奶中含有较高的雌性激素，其随着奶牛妊娠天数的增加而增加，在妊娠第41至60d内硫酸雌酮的浓度即可迅速上升到151 pg/ml，在第220至240d内其浓度达到最高，约1000 pg/ml[8]。本实验中所用妊娠奶牛奶(妊娠212至221d)和市售纯牛奶混合后乳清TE2浓度分别为234.81 pg/ml(861.75 pmol/L)和240.74 pg/ml (883.52 pmol/L)，按总雌酮、TE2和TE3占雌激素比例分别约为7:2:1[8]进行推算，其硫酸雌酮浓度分别约为821.84 pg/ml和842.59 pg/ml，虽检测方法不同，均与妊娠第220～240d乳清硫酸雌酮浓度接近，提示其很可能相当部分在妊娠奶牛奶范围；市售纯牛奶与妊娠奶牛奶乳清中P4浓度接近，分别为3.66 ng/ml(14.21 nmol/L)和4.47 ng/ml(11.64 nmol/L)，均在Chenault等[13]报道的妊娠奶牛奶脱脂奶浓度范围(妊娠193～220d，2.5～6.5 ng/ml)之内，亦提示其很可能相当部分在妊娠奶牛奶范围。

人体和实验动物体内血脂水平可受一定水平的外源性雌性激素影响。绝经后妇女口服乙炔基E2 (15 μg/d)21d后[14], 其血清TC和LDL-C降低，HDL-C和TG升高。Parini 等[15]研究显示8~9周龄雌性大鼠每日皮下注射不同剂量的E2，7d后较大剂量的E2(0.2～4 mg/kg)可降低其血清TC和HDL-C水平，而生理剂量的E2(≤0.04 mg/kg)则可升高其水平，且口服不同水平的E2也有类似作用。

本实验妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶组在青春期前摄入的乳清TE2[ng/(kg·d)]分别约为39.97、31.61、43.72和30.20，青春期分别约为36.67、29.28、37.65和25.38，可见妊娠奶牛奶和市售纯牛奶组在实验中摄入的TE2较其它两组高。按牛奶乳清中总雌酮、TE2和TE3的比例为7:2:1[8]计算，上述4组在青春期前摄入的乳清雌激素总量[ng/(kg·d)]分别约为199.85、158.05、218.60和151.00，青春期分别约为183.35、146.40、188.25和126.90。但纯牛奶的脂肪和酪蛋白中也含有相当量的雌激素，如市售纯牛奶与其乳清中17-β E2比例为6.4:1.5[16]，即使将乳清、脂肪和酪蛋白中的雌激素均计算在内，4组摄入的奶液中雌激素总量均不到0.001 mg/(kg·d)，远低于Parini 等[15]研究的生理剂量高限，本研究结果虽对TC无影响，但其对血清HDL-C的作用却一致，即均有升高血清HDL-C的作用，此现象难以仅用E2来解释。

牛奶中亦含有孕激素。本实验妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶组在青春期前摄入乳清中P4[ng/(kg·d)]分别约为760.85、507.14、664.73和122.32，青春期分别约为697.99、469.79、572.45和102.81，可见妊娠奶牛奶和市售纯牛奶组在实验中摄入的P4的量与TE2一样，也较其它两组高。有研究显示绝经后妇女[17]雌孕激素联合治疗可使其血清HDL-C水平升高，提示本实验妊娠奶牛奶和市售纯牛奶升高青春期雌性SD幼鼠血清HDL-C的作用很可能是牛奶中TE2和P4共同作用的结果，并且妊娠奶牛奶对中老年妇女心血管是否也具有保护作用是一非常有趣和值得关注的课题。

同时，体内血脂水平亦受内源性雌性激素的影响。Tomaszewski等[18]研究认为男性体内E2水平每升高1个标准差，则TC升高0.06个标准差，HDL-C降低0.06个标准差；E1水平每升高1个标准差，则TC和LDL-C分别增加0.12和0.13个标准差。虽然血清E2能较好反映幼鼠体内雌激素水平，本实验在预实验中检测了青春期前雌性SD大鼠血清E2，但均在ICMA可检测范围下限，故本实验采用了尿TE3、生殖器官脏器指数和动情周期等指标反映体内雌激素水平。结果显示各组尿TE3、动情周期和生殖器官脏器指数差异均无统计学意义，提示在常规检测手段发现体内激素和生殖系统改变之前，牛奶中增高的雌性激素有可能已经影响幼鼠血脂代谢，也可能牛奶中还有一些因素与雌性激素协同影响血脂代谢，尚有待探索更敏感的研究指标或扩大样本量进一步研究。

青春期前雌性SD幼鼠血脂组间无差异，而青春期血清HDL-C水平出现差异，提示干预时间与血脂水平可能有关。牛奶中雌性激素水平、干预时间和血脂水平三者关系有待进一步研究。

参 考 文 献：

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收稿日期：2009-06-09

基金项目：第五批(2007年度)苏州大学医学发展基金项目(21)

作者简介：徐庄剑（1959—），男，教授，本科，研究方向为儿科内分泌和代谢。